paper 2：转录组 mirna 降解组相关文章-利来w66国际

plant biotechnology journal

doi: 10.1111/pbi.13026

vanika garg1,2, aamir w. khan1, himabindu kudapa1, sandip m. kale1, annapurna chitikineni1, sun qiwei3,mamta sharma4, chuanying li3, baohong zhang5, liu xin3 , p.b. kavi kishor2 and rajeev k. varshney1,*

ascochyta blight ab枯萎病是限制全国范围的鹰嘴豆的产量的主要生物胁迫因素。为了剖析鹰嘴豆抵抗ab的复杂机制，使用转录组，small rna 和降解组测序方法。

在两个时间点（接种第3天和第7天）,在控制和胁迫的条件下，对20种样品的转录组进行了测序，包括两种抗性基因型、两种易感基因型和一种渗入型，共鉴定出6767个表达差异基因deg。这些deg主要与发病相关的蛋白、抗病基因，如nbs-lrr，细胞壁生物合成和各种次生代谢合成基因有关。样品的small rna测序结果鉴定出651 mirnas，其中包括478个已知的mirnas，173个新mirnas。在不同基因型、状态和时间点，共有297个mirna差异表达。使用降解组测序和计算机方法，预测了629个mirnas的2,131靶标。smallrna和转录组数据结核确定了在抗性和易感基因型中表现相反的表达，并且在ab感染期间可能转录后沉默的基因子集的 12个mirna-mrna相互作用对。这项研究的综合性分析the comprehensive integrated 为鹰嘴豆胁迫相关的转录动力学和调控网络分析提供了更好的简介，且为鹰嘴豆的改良提供了候选基因。

在这项研究中，20个样品代表两个温和的抵抗基因型(iccv 05530 and ilc 3279)，两个易感基因型 (c 214 and pb 7)和一个渗入品系（bc3f6)，在两个接种时间点进行测序。20个样品的paired-end sequencing 共产生了1.351亿个reads。严格的质量过滤后供进一步分析，再比对到鹰嘴豆的基因组，并对基因按照基因型和时间条件进行命名。

差异基因表达汇总

为了研究差异基因的表达情况，过滤掉低质量的表达基因（fpkm>=1，且定量状态为ok），发现一个样品中至少表达了21,527个基因。过滤掉低表达基因，使用cuffdiff 计算34成对组合中的基因倍数的变化。总共发现6,767个基因在每两个样品间显示出明显的差异表达。

在bc3 f6-c-3d :pb 7-c-3d=star 284 (183 up-regulated; 101 down-regulated):over 2607 (953 up-regulated; 1654 down-regulated)

在ab感染后，第3天的下调趋势更加明显，第7天则发现每种基因型中更多的基因被上调

在对照条件下，从不同基因型中鉴定出大量的deg，在第3 dpi时ilc 3279与pb 7之间的deg数量最多（901上调； 255下调255），而ilc 3279与c 214之间的deg最高（812上调； 1290下调）在第7 dpi（图1b）。

同样，在感染后，在第3 dpi时发现ilc 3279和pb 7（上调811；下调581）之间的最大deg，在第7处iccv 05530和c 214（上调953；下调1654）之间发现最大deg。 dpi（图1c）。

可以看出，每种组合的deg大部分都是唯一的。

这些结果表明，鹰嘴豆中真菌感染后基因型和阶段特异性反应。

go富集分析

在6,767个重要的degs中，使用blastx注释了5,309个基因，并go将其分配给4,559个基因，共获得10,962个go项。

可以看出，deg的go分配给 the biological process (3632), molecular function (3744) 、 cellular component (3586) .

对deg的go富集分析表明，

在生物过程类别项目下，显著的terms是：oxidation-reduction process (go:0055114), regulation of transcription (go:0006355), defense response to fungus (go:0050832), response to chitin (go:0010200), response to salicylic acid(go:0009751), response to jasmonic acid (go:0009753), response to abscisic acid (go:0009737),ethylene-activated signaling pathway (go:0009873) 、response to auxin (go:0009733)

在分子功能类别中，显著的terms是：atp binding (go:0005524), protein serine/threonine kinase activity (go: 0004674), oxidoreductase activity (go:0016491), peroxidase activity (go:0004601), hydrolase (go:0016787) and monooxy genase activity (go:0004497)

在细胞成分类别中，最为丰富的是： plant-type cell wall (go:0009505), apoplast (go:0048046) and anchored component of membrane (go:0031225)

显著丰富的go项目进一步聚类以获得高度连的clusters。

这个f 2a，也是go的富集性差异基因的图，可考虑换个方式作图。kegg差异基因通路

此外，为了理解分子机制，使用kegg进行了degs分子途径分析。发现degs共代表134条途径。

富集分析表明，在ab感染下，最富集的途径是：metabolic pathways (ko01100), biosynthesis of secondary metabolites (ko01110), plant hormone signal transduction (ko04075) and plant-pathogen interaction (ko04626)

4.在该项研究中，891个transcription factor（tf） encoding genes 属于50个基因家族。

其中，代表最多的tf家族是 bhlh (91), erf (90), myb (75), nac (68) and wrky (65) ；并且达县大量的其他tf家族（如c2h2，bzip和mads）在应激条件下显示出不同的表达模式；

研究了在应激条件下所有基因型中10个最富集的差异表达特异性。可以看出，在第7天时，所有基因型中差异表达的tf编码基因的数量都更高。且抗性基因型比易感基因型差异表达的wrky成员的数量相对更多。

例举相关的文章和其中类似的结果进行陈述。

​ 防御反应设计植物中大量的转录重编程，使用聚类分析，确定了不同时间点和易感基因型具有相似表达趋势的基因，其中相似表达谱，degs分为六个主要clustered。

在控制条件下，抗性基因型上调趋势更为深刻。clusteri 由第3dpi或者第7dpi显示抗性基因型诱导表达的基因组成。这些基因的go富集表明，大多数基因参与了salicylic acid, metabolic process, oxidation-reduction process, flavonoidbiosynthetic process and response to biotic stimulus。并且，抗病基因簇重要组成成员为chitinases (ca_04405), cc-nbs-lrr (ca_08361) and dirigent protein (ca_20726)。

在对照条件下，另一个clusterii，在第3或者第7dpi显示抗性基因型中的基因表达收到限制。这些基因主要与auxin, catabolic process, oxidoreductase activity, heme binding and xylan acetylation有关。其中包括生长素响应原件，与同源异型相关的tf和类似的erf和dof在这个tf群中。

另外，当鹰嘴豆暴露于ab胁迫下时，观察到第3dpi和第7dpi显示诱导表达的cluster iii。该簇 iii主要包括pathogen recognition and defense response，如leucine-rich receptor-like kinase, nbs-lrr proteins, oxidation-reduction process, cuticle development and fatty acid biosynthesis。

cluster iv 包括在第3dpi抵抗型基因中显著上调的基因，该簇主要包括pathogen recognition and defense response like leucine-rich receptor-like kinase, nbs-lrr proteins, oxidation-reduction process, cuticle development and fatty acid biosynthesis。

cluster iv在第3dpi抵抗型基因型中显著上调的基因。包括：defense response to fungus, chitin catabolic process, signal transduction, peroxidase activity and oxidation-reduction process. a number of stress-responsive genes like pathogenesis-related (pr) proteins, chitinases, kunitz-type trypsin inhibitor, glutathione(楚楚baby是什么梗？楚楚baby这个梗就是出自抖音上面一位叫辣目洋子出演的搞笑视频，这个视频里面，辣目洋子饰演的是一个非常火的网络主播，名字叫“楚楚baby”。然而楚楚baby却因为太火了，所以遭到歹徒的绑架，绑匪看到本人不相信这个就是楚楚baby，之后把手机拿出来打开美颜和滤镜，结果发现，她就是所谓的“楚楚baby”这个梗也就是用来嘲讽那些见光死的网红，不管在直播面前多么的好看，看到本人之后竟然都不认识了。)-s-transferase (gst), tir-nbs-lrr, and dirigent proteins along with tfs like bhlh, wrky and myb were a major part of this cluster。观察到，与易感基因型相比，编码抗病反应蛋白drrg49-c (ca_02987) 在所有抗性基因型上均表现出5.5倍的平均log2。并且发现该簇许多基因在第7dpi不耐性基因型时显著被抑制。包括几个应激反应基因，如，dirigent, syntaxin, cobra, kunitz-type trypsin inhibitor and aquaporins。

cluster v 在抗性基因型中仅在第7dpi显示出调控的基因组成。该簇包括与细胞壁生物合成有关的基因，包括：cellulose synthase (ca_08607), cell wall loosening like expansin and ion homeostasis including nramp5 (ca_25717)。

cluster vi在第3dpi和第7dpi表现出易感基因型的诱导表达。该簇基因主要涉及 defense response, proteolysis, response to abscisic acid, response to salicylic acid, hydrolase activity, jasmonic acid and ethylene mediated signaling pathway, protein phosphorylation and leaf senescence.诸如：senescence-associated protein (ca_10582), accelerated cell death 11 (ca_08010), desiccation�related protein (ca_08076), jasmonate o-methyltransferase (ca_04771), leucoanthocyanidin dioxygenase-like protein (ca_17705), pectinesterase (ca_20384) and calcium-transporting atpase (ca_12185) and tfs encoding for nac, myb and erf were up-regulated in susceptible genotypes。有趣的是，该簇的大多数基因，衰老相关和加速细胞死亡蛋白，在易感基因型中在第3dpi中受到限制，并在第7dpi中受到诱导。

为了鉴定鹰嘴豆中与ab胁迫相关的mirna，共构建了20个小rna文库并进行测序。总共产生了5.328亿reads，每个样本平均产生2600万次。在过滤低质量读数并进行修整后的后续步骤之后，保留了5.172亿高质量读数集，用于进一步分析。丢弃了大约6000万条长度小于18nt或者大于35nt的读段，除去定位的重复序列以及ribosomal rna (rrna), transfer rna (trna) and small nucleolar rna (snorna) 。unique small rna reads 指出24nt（51.2%）最丰富的类别，23nt和22nt其次。

例举相似文献高表达在24nt。 implies the abundant representation of endogenous sirnas in all the samples analyzed, in concurrence with previous studies

为了鉴定鹰嘴豆中conserved/known mirnas，对mirbase中其他物种的mirna过滤后reads中，共有1,120万条reads被定位到mirbase，从而在所有样品中坚定了478个unique conserved。除了conserved mirnas，植物还具有物种或者谱系species-或者lineage-特定的新型mirna。因此，对无法匹配的mirbase reads 进行了novel mirnas预测。通过mirdeep-p 软件处理了总共42万条未错配的鹰嘴豆基因。简而言之，将匹配的reads延伸获得precursor reads（使用vienna 包进一步折叠成潜在的stem-loop结构的precursor reads ）。过滤并处理characteristic mirna precusor 二级结构。在去除不符合植物mirna标准且样品中少于10reads的mirna，最终获得了173个unique mirna。

mirna总数范围从pb7-c-7d的339个到bc3f6-s3d中的471个。长度范围在20-24nt，其中丰度最高的是21和24。the 20–24 nt length of mirnas is in agreement with the products of dcl cleavage activity (reinhart et al., 2002).

评价了成熟的mirna候选的核苷酸组成，发现大多数长度在21nt的mirna多数组成由50个尿苷残基。且，许多植物都观察到21nt的长度的mirna存在50个尿苷酸残基，这是dcl1裂解和ago1的特征属性。

鹰嘴豆的mirna平均gc含量在48%，这个与紫花苜蓿（44%），拟南芥（45%），大豆（46%），葡萄树（%）的gc含量相似。

基于相似性，已知的mirna聚类将它们分成240个家族，其中mir166家族最大，有46个成员，其次mir156（44）和mir171（33）。

此外，发现有5个novel mirnas聚类成conserved mirnas ，这些mirna肯呢个构成了最新进化的的conserved families。

为了区别对ab有反应的mirna,对鉴定出的mirna在文库中的表达模式进行了研究。

大多数已经鉴定的mirna至少在一个样品中已经表达。在本研究中，297个mirna在不同的组合中显示出显著表达差异模式，大多数mirna在压力条件下显示出下调趋势。

大量的mirna以基因型和阶段特异性方式表达差异。在胁迫下，约有25%的差异表达mirna在第3dpi和44%的mirna的第7dpi是基因型特性。例如，for example, mir156h-3p was highly induced (average log2 fold change 4) at both 3rd and 7th dpi specifically in ilc 3279 genotype

此外，为了查询mirnas与ab抗性有关的mirna,通过比较在胁迫下的抗性和易感基因型，研究了包括渗系在内的所有抗性基因型表现出相似的表达模式的mirna。

结果显示，耐药基因型中第3和第7dpi三个novel mirna(nov_mir3a, nov_mir64,nov_mir171) 显示上调。在第3dpi和第7dpi，总共7中mirna包括抗性基因显示下调（mir3627b, mir2111l, mir2111-3p, mir1507b, nov_mir123, mir166i-5p and nov_mir81）。在第7dpi时，mirna下调的趋势更加明显。共有8和21个mirna在抗性基因型中分别在第3和第7dpi特异下调。同样，

……

太多了，写不完，不写了。:sweat_smile:

植物mirna使用silico通常具有完美或接近完美的互补性。使用psrnatarge server,我们确认了总共593个（已知的429个已知和164个新mirna）可识别1735个靶标。

此外，使用降解组测序，共产生了1.458亿个序列reads，平均每个样品有1,460万个reads。经过连续过滤步骤，获得了1.344亿reads，这些读数已被用于鉴定切割位点。

为了清晰分析，样品指定为基因型条件。例如，在对照条件下，ilc 3279-c 代表ilc 3279 。在每个样品中，平均鉴定出p<=0.05，类别<=4的non-redundant 目标。确定了最大targets为 ilc 3279-c (201)，最小为pb 7-c (151)。对于每个样品，最大切割位点属于类别0（平均41.4%），最小切割位点为类别4（平均12.7%）。这些切割位点以靶标图（target plots）（t-plots）表示。

使用降解组测序，我们鉴定出407（已知324个和83个新颖的）mirna确定552个靶标。

通过silico和降解组分析，几乎所有（96.6％）mirna均被鉴定出2131个靶标。

可以看出，针对mir396家族（148）获得最大八点，其次为mir(106)、mir156(80)。对靶标的注释信息表明，他们主要属于tfs, phytohormones, stress-responsive genes, disease resistance genes like nbs-lrr, cellular enzymes like kinases, reductases and phosphatases。（tf靶标的mrna转录本也代表了相当一部分的mirna靶标。）总共确定了属于35个家族的192个tf。最大的靶标来自于myb（17.2%)，其次的bhlh (7.8%) and arf (6.8%)。

进一步进行go富集分析，以阐明mirna靶标在鹰嘴豆中应对ab胁迫的潜在作用。这些靶标被同一分配给1,470个生物过程，1,477个细胞成分和1,503个分子功能。

其中丰富的生物学过程包括：rna modification (go:0009451), plant-type secondary cell wall biogenesis (go:0009834), defense response (go:0006952), response to jasmonic acid(go:0009753), signal transduction (go:0007165) and response to salicylic acid (go:0009751)。

在分子功能中，最重要的goterms为endonuclease activity (go:0004519), mirna binding (go:0035198), oxidoreductase activity (go:0016722) and xylan o-acetyltransferase activity (go:1990538)。

在细胞类别成分中，最over-represented terms为 nucleus (go:0005634), plasma membrane (go: 0005886) and mitochondrial inner membrane pre-sequence translocase complex (go:0005744)。

此外，进行了kegg注释，以探索已鉴定的mirna靶标的通路。

其中，总共鉴定出214条通路目标，表明这些靶标的功能高度多样化。丰度最高的通路与胁迫有关的途径，包括：plant-pathogen interac�tion, plant hormone signal transduction, biosynthesis of secondary metabolites and mapk signaling pathway 。

此外，为了研究ab反应性mirna和靶标之间的联系，使用cytoscape进行网络分析。对于为那个罗的构建，包括了stress-responsive mirnas and genes involved in ab stress response。

这些应激反应基因包括：pr proteins, glycosyltransferases (gt), pentatricopeptide repeat proteins (ppr) and disease resistance genes like nbs-lrr and snakin。还包括几个tf，例如nac, erf and arf。

此外，整合了ab反应性mirna（来自小rna-seq）和它们的靶基因（来自rna-seq）的表达，以推断mirna在ab感染过程中的介导作用。

1.使用pearson相关系数对mirna和其靶标mirna表达谱进行相关分析，分别确定了在第3dpi和第7dpi胁迫条件下所有组合共有757和693mirna-mrna相互作用对。这些相关作用可以是连贯性的，也可以是不连贯性的。连贯性作用是当mirna表达更小是mrna表达较多时的相关作用。反之亦然。

相反，非连贯性在mirna和mrna的靶标中有相似的表达。

在757对中，在第3dpi时，有371对是non-coherent，而386对是coherent。

同样，在第7dpi时，693对中，357对是noncoherent，336是coherent。

我们进一步详细分析了coherent的相互作用。

在第3dpi时，由274个基因组成的386coherent pairs 发现了247个mirna. 同样,在第7dpi时,鉴定出336个coherent pairs,包括262个基因和232个mirna。与靶向它们的mirna相比，更高数量的基因支持以下发现：单个mirna具有切割多个靶标的能力。

2.从这些相关对中，我们可以鉴定出12对在抗性（包括bc3f6品系）和易感基因型之间均表现出mrna和mirna的相反表达。从这些对中，分别从3 dpi和7 dpi识别出五对和七对。

3.易看出，与易感基因型相比，在抗性基因型中有更多的mirna被下调，其相应的靶标也被上调。

在所有抗药性基因型中，在第3 dpi时，mir159k-3p，mir482b-3p和mir156r等三个mirna均被下调，其靶渗透压样蛋白，nbs-lrr和squamosa启动子结合样蛋白分别被上调-规范的。

与这些已知的mirna一起，还发现了靶向g型凝集素s受体（如丝氨酸苏氨酸激酶）的新型mirna nov_mir66

相反，在所有抗性基因型中，mir3191均被上调，其靶标tcp转录因子被下调。在第7 dpi时，三个mirna（包括mir171b，mir5232和mir157a）被上调，而它们的靶标，erf基因，钙转运atpase和与感觉相关的蛋白在抗性基因型中被下调。相反，四个mirna，即mir162，mir167c，nov_mir101l和mir171被下调，而它们的靶标，dicer样基因，dof锌指，刀豆蛋白和ppr蛋白在抗性基因型中被上调。有趣的是，在这两个时间点，疾病抗性基因（例如nbs lrr（第3 dpi），渗透素（第3 dpi）和ppr（第7 dpi）蛋白）均被上调，而靶向它们的mirna在耐药中被下调基因型与易感基因型相比。

4.在这12对mirna-mrna对中，也通过降解组测序验证了5对。这些对包括mir482b-3p：cc-nbs-lrr（ca_08122），mir167c：dof锌指蛋白（ca_19433），mir171b：erf（ca_00359），mir157a：衰老相关蛋白（ca_15107）和mir5232：钙转运atpase（ ca_12185）。

这12对中的4个基因位于先前报道的ab抗性qtl中。 anbessa等人将ca_02420与qtl在ca8上共定位。 （2009），tar’an等人在ca3上的ca_08122。 sabbavarapu等人（2007），ca6上的ca_08506和ca4上的ca_04572。 （2013）